脂質ナノ粒子化した抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 による細胞分化と炎症の制御

仲こゆき¹, 高谷智英^1,2.

信州大学大学農学部.
信州大学大学院総合理工学研究科.

日本核酸医薬学会第10回年会 (神戸), 2025/07/02 (ポスター).

Abstract

細胞核内のヌクレオリンを標的とするアプタマー iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’) は、細胞分化や炎症応答を制御することから、核酸医薬品としての応用が期待される。iSN04 は、骨細胞や筋細胞の BMP シグナルを阻害し、骨分化を抑制して筋分化を促進する。また、iSN04 は、TNF-α や TLR リガンド依存的な NF-κB の核内移行を阻害して炎症反応を抑制する。しかし、iSN04 の有効濃度は uM レベルと高く、創薬シーズとして課題が残る。本研究では、脂質ナノ粒子化した iSN04 (LNP-iSN04) を作成し、ネイキッドな iSN04 と比較して有効濃度が低下するかを検証した。

コミナティ組成の脂質と iSN04 をバッチタンク内で攪拌し、LNP-iSN04 (φ72 nm) を作製した。対照には iSN04 を含まない LNP を用いた。

骨芽細胞に BMP2 と iSN04 または LNP-iSN04 を投与し、アルカリフォスファターゼ (ALP) を指標に骨分化を評価した。BMP2 依存的な ALP 活性は、10 uM の iSN04 と 500 nM の LNP-iSN04 で同程度に低下した。筋芽細胞に BMP2 と iSN04 または LNP-iSN04 を投与し、定量 PCR で筋分化を評価した。BMP2 による筋遺伝子の発現低下は、iSN04 で回復したが LNP-iSN04 では変化しなかった。

次に、iSN04 または LNP-iSN04 で処理した筋芽細胞に TLR1/2 リガンド (Pam₃CSK₄) で炎症を誘導し、NF-κB を免疫染色した。Pam₃CSK₄ 依存的な NF-κB の核内移行は、iSN04 と LNP-iSN04 で同程度に阻害された。血管平滑筋細胞と TNF-α で同様の試験をした結果、NF-κB の核内移行は iSN04 で阻害されたが LNP-iSN04 では変化しなかった。

500 nM の LNP-iSN04 は、骨芽細胞の分化と筋芽細胞の炎症を抑制したが、筋芽細胞の分化や血管平滑筋細胞の炎症には作用しなかった。LNP-iSN04 のさらなる低濃度化と適用範囲の拡大には、細胞の種類や反応に適した LNP 組成の探索が必要と考えられる。

The anti-nucleolin aptamer iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’), which targets nuclear nucleolin and interferes with BMP signaling, suppresses bone differentiation of osteoblasts and promotes skeletal muscle differentiation of myoblasts. iSN04 also inhibits nuclear translocation of NF-κB induced by TNF-α and TLR ligands, resulting in suppression of inflammatory responses in myoblasts and vascular smooth muscle cells (VSMCs). iSN04 is anticipated as a drug candidate for musculoskeletal diseases, however, the effective concentration of iSN04 is ~10 uM, which is much high for a nucleic acid drug for clinical application. In this study, we prepared the lipid nanoparticle-encapsulated iSN04 (LNP-iSN04) and evaluated its effective concentration on cell differentiation and inflammation compared with naked iSN04.

LNP-iSN04 (φ72 nm) was prepared by stirring iSN04 and lipids used for Comirnaty vaccine (BNT162b2) in a batch processing tank. LNP without iSN04 was used as a negative control.

Osteoblasts were stimulated with BMP2 in the presence of iSN04 or LNP-iSN04, and their differentiation was quantified by alkaline phosphatase (ALP) activity. BMP2-induced ALP activity was reduced in the same manner by both 10 uM naked iSN04 and 500 nM LNP-iSN04. Myoblasts were also stimulated with BMP2 in the presence of iSN04 or LNP-iSN04, and their differentiation was assessed by quantitative real-time PCR. The BMP2-dependent downregulation of myogenic gene expression (myogenin and myosin heavy chain) was reversed by iSN04 but not by LNP-iSN04. Myoblasts were pre-treated with iSN04 or LNP-iSN04, stimulated with a TLR1/2 ligand (Pam₃CSK₄), and subjected to immunostaining for NF-κB. Pam₃CSK₄-induced nuclear translocation of NF-κB was blocked equally by 10 uM naked iSN04 and 500 nM LNP-iSN04. In contrast, experiments with VSMCs and TNF-α showed that nuclear translocation of NF-κB was inhibited by iSN04 but not by LNP-iSN04.

LNP-iSN04 at a concentration of 500 nM reliably suppressed osteoblast differentiation and myoblast inflammation as well as 10 uM naked iSN04, but did not affect myoblast differentiation and VSMC inflammation. For clinical application, the effective concentration of LNP-iSN04 needs to be further reduced and LNP-iSN04 should be made to act on different cell types. Optimization of the lipid composition and the ratio of lipid to iSN04 will improve the function of LNP-iSN04.