筋形成型オリゴ DNA は BMP-Smad1/5 シグナル経路を阻害して異所性骨化を抑制する

筋形成型オリゴ DNA は BMP-Smad1/5 シグナル経路を阻害して異所性骨化を抑制する

石田智香1, 松島もも1, 高谷智英1,2.

  1. 信州大学大学院総合理工学研究科.
  2. 信州大学大学農学部.

日本農芸化学会2026年度大会 (京都), 2026/03/10 (口演).

Abstract

軟部組織に骨が形成される異所性骨化は、過剰な骨形成タンパク (BMP) シグナルによって生じる、外傷や手術の合併症である。乳酸菌ゲノムに由来する筋形成型オリゴ DNA「iSN04」は、核タンパク質ヌクレオリンに結合する核酸抗体として働く。iSN04 は、マウス筋芽細胞株 C2C12 の BMP2 依存的な筋分化阻害を回復して骨分化を抑制するため、異所性骨化の治療薬として期待される。本研究では、C2C12 細胞における Smad1/5 のリン酸化と核内移行に iSN04 が及ぼす影響を調べた。

C2C12細胞を 10 uM の iSN04 で３時間前処理した後、100 ng/ml の BMP2 で１時間刺激した。ウェスタンブロットの結果、BMP2 刺激で有意に増加するリン酸化 (p-)Smad1/5 のタンパク質量は、iSN04 の前処理によって有意に減少することがわかった。免疫染色の結果、BMP2 依存的な p-Smad1/5 の核内移行は、iSN04 の前処理によって阻害されることがわかった。プロモーターに Smad5 結合配列を含むルシフェラーゼレポーターを C2C12 細胞に導入し、ルシフェラーゼ解析を行った結果、BMP2 投与で増加するルシフェラーゼ活性が iSN04 投与で減少する傾向を認めた。

以上の結果から、iSN04 によるヌクレオリン阻害は、BMP2 依存的な Smad1/5 のリン酸化と核内移行を抑制することで BMP シグナルをブロックし、筋遺伝子の発現を回復させ、骨遺伝子の転写を抑制することが示され、iSN04 が異所性骨化を抑制する機序の一端が明らかとなった。

Heterotopic ossification (HO) is the ectopic bone formation that is induced by excessive bone morphogenetic protein (BMP) signaling. iSN04 is a myogenetic oligodeoxynucleotide designed from the genome of lactic acid bacteria that acts as an anti-nucleolin aptamer. Because iSN04 suppresses the osteogenesis of the murine myoblast cell line C2C12 by restoring BMP-inhibited myogenesis, it could be a candidate drug for HO therapy. This study investigated the effect of iSN04 on the phosphorylation and nuclear translocation of Smad1/5 in C2C12 cells. The cells were pre-treated with iSN04 and then stimulated with BMP2. Western blotting revealed that iSN04 significantly decreased BMP2-increased Smad1/5 phosphorylation. Immunostaining showed that BMP2-dependent nuclear translocation of phosphorylated Smad1/5 was inhibited by iSN04. Luciferase assay demonstrated that iSN04 suppresses BMP2-induced promoter activity containing Smad5-binding sites. These results indicate that iSN04 suppresses HO by blocking BMP signaling through the inhibition of Smad1/5 phosphorylation and nuclear translocation.

Keywords

aptamer, heterotopic ossification, myogenetic oligodeoxynucleotide (myoDN)